流式细胞术在2020年欧洲血液学年会（EHA）上大放异彩
2020年新冠疫情全球肆虐，但疫情并未阻挡血液界学者对学术研究和交流分享的热情。承载众多看点的第25届欧洲血液学协会（EHA）年会，在大家的期待中采用线上虚拟会议的模式如期举行。
作为欧洲血液学领域规模最大的国际会议，EHA年会每年吸引来自全球100多个国家的上万名专业人士与会，一起分享、探讨有关血液学的创新理念及最新的科学和临床研究成果，能够登上EHA舞台，表示在血液学领域具有较高的学术水平。此次，陆道培医学团队有3项研究成果亮相EHA大会，向世界展示和分享陆道培医学团队最新科研成果。
研究一：使用cCD79a设门的多色流式可以有效监测CD19-CAR-T治疗B-ALL后MRD，并且预测桥接移植的预后
第一作者流式细胞室陈曼医师的文章“Multicolor Flow Cytometry Panel with cCD79A Gating to Detect Minimal Residual Disease in Patients with B-Lymphoblastic Leukemia/Lymphoma Post Anti-CD19 CAR-T Therapy Bridging to Allo-HSCT”（胞浆CD79a抗体设门多色流式法监测CD19-CAR-T桥接异基因移植治疗难治复发急性B淋巴细胞白血病）（摘要号：S113）被选为口头发言。
陆道培医疗集团在CD19嵌合抗原受体T(CD19-CAR-T)细胞治疗急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）中有丰富的经验，尤其是桥接异基因造血干细胞移植，挽救了无数难治复发患者生命。这类疾病的病情监测、疗效评价、预后评估中，流式细胞术（FCM）微小残留病变（MRD）检测技术起到不可或缺的作用。
但是常规的B-ALL的MRD多色流式检测方法均使用CD19设B细胞门，而CD19-CAR-T治疗后，由于13-60%的MRD阳性或者复发患者肿瘤细胞会或多或少丢失CD19，故不再适合使用传统方案监测MRD。以王卉主任、陈曼医师为代表的团队，探讨了陆道培医疗集团流式细胞室使用胞浆CD79a（cCD79a）抗体设门多色流式细胞术检测MRD方法在CD19-CAR-T治疗中的有效性，并研究其在输注后桥接异基因移植（allo-HSCT）整个治疗过程中的评价疗效及监测预后的作用。
实验中分别选取10例B-ALL完全缓解（CR）患者的骨髓标本及10例B-ALL MRD阳性的骨髓标本，同时使用新方案与经典方案进行检测，采用线性回归方法进行结果一致性分析，证实两种方案的一致性好。
然后选取2016年6月~2017年5月于河北燕达陆道培医院经CD19-CAR-T细胞输注后桥接移植的59例患者，使用新方案进行骨髓MRD监测，中位随访24月。其中51例（86.44%）患者CD19-CAR-T后FCM-MRD阴性，8例（13.56%）患者CAR-T细胞输注后MRD阳性或者复发。两组病例均在中位时间1-2个月左右进行了异基因造血干细胞移植。
经单因素卡方检验分析，CD19-CAR-T后移植前以及移植后FCM-MRD均与移植预后有强相关性（分别为P<0.0001，P=0.000）。59例患者中，移植后复发总计9例，其中7例死亡，4例为移植前FCM-MRD阳性患者（占带瘤移植组50%，4/8例），3例为FCM-MRD阴性移植患者（占MRD阴性移植组5.88%，3/51例），2例复发后缓解均为移植前FCM-MRD阴性患者。
结论认为，使用cCD79a设门的多色流式B-ALL检测MRD方案，可以有效监测CD19-CAR-T后MRD，并且预测CD19 CAR-T后桥接移植的预后。
研究二：流式细胞术微球法检测24种细胞因子在CAR-T治疗中的应用
第一作者细胞冻存室王东出医师的文章“EP403 Monitoring 24 Cytokines by Cytometric Bead Array during the Chimeric Antigen Receptor T Cells Treatment”（流式细胞术微球法检测24种细胞因子在嵌合抗原受体T细胞治疗中的应用）被选为墙报展示。
研究表明在CAR-T治疗中，多种细胞因子在细胞因子释放综合征（CRS）或者细胞因子风暴中起到重要作用，因此细胞因子检测是评价CAR-T副作用的重要指标。流式细胞微球阵列技术（CBA）是最近发展起来的一项新技术，与传统的ELISA方法相比，具有灵活、快速、高性价比、节约标本等优点。以王卉主任、王东出医师为代表细胞冻存室团队设计了一项新的24种细胞因子组合方案，使用CBA方法评价了其在CAR-T患者的脑脊液和外周血细胞因子检测中的作用。
他们首先进行了方法学对照性研究，收集了29例健康志愿者的外周血，25例回输CD19-CAR-T细胞后的ALL患者外周血标本，分别使用ELISA（Quantikine,RND）检测四种常见细胞因子（IL-6、IL-10、IFN-γ、可溶性CD25（sCD25）），与CBA（北京旷博公司）方法进行了比较。结果表明，每种技术均有很好的重复性，两者相关性很好。
为了研究CAR-T后细胞因子变化曲线，研究者选取的25例CAR-T治疗患者每人至少采集了5个时间点。由于标本量的问题，ELISA方法只做了正常对照和患者的外周血标本，CBA方法除了检测外周血标本，还对41例未做CAR-T的完全缓解患者脑脊液标本和15例CART治疗后脑脊液标本进行了检测。
结果表明，在健康对照和患者外周血标本组，虽然IL-6和sCD25检测的绝对值两种技术有差异，但是两种方法均可满意显示CAR-T治疗后细胞因子变化曲线，一致性很高。尤为重要的是，CBA技术检测脑脊液和外周血均有临床实用性强的特点。CBA方法可以一次完成24种细胞因子的检测，因此节约标本，让脑脊液这种微量标本检测成为可能；各种标本的检测中都解决了ELISA方法必须批量检测，随意性差的特点，相比之下检测时间短、性价比高，不论大批量还是急诊随机性标本都适合。
2020年2月起，陆道培医疗集团已经将CBA方法24种细胞因子检测技术全面推向临床，这项技术不仅可用于CAR-T治疗患者的监测，同时在各种良、恶性疾病的诊断、治疗，感染的免疫指标评价，移植物抗宿主病、CMV、EBV或者其他感染等移植后并发症的诊断、评价，噬血综合征等特殊免疫状态的监测与防治中，都起到极为重要的作用。
研究三：CD69在AML微小残留病变检测中的意义
第一作者流式细胞室宫美维医师的文章“The Clinical Significance of CD69 Detection in Minimal Residual Disease of Patiens with Acute Myeloid Leukemia”（CD69在急性髓系白血病微小残留病变检测中的意义）被选为大会论文集。
微小残留病变（MRD）是恶性血液病重要的疾病监控、判断预后、指导治疗的指标，目前临床常用的灵敏度较高的检测方法包括实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）、多色流式（MFC）等。MFC通过分析细胞抗原表达情况区分正常细胞与异常细胞，具有快速、性价比高、覆盖范围广、灵敏度高、特异性高的特点。目前流式细胞术对急性髓系白血病（AML）检测敏感性为10-3~10-4，虽然文献报道覆盖率为80-95%，但是临床工作中低比例（低于0.1%）MRD检测、以及缺乏特异性标志的标本检测仍旧遇到瓶颈。以王卉主任、宫美维医师为代表的流式细胞室团队进行了一项研究，探讨CD69在急性髓系白血病（AML）微小残留病变（MRD）检测中的临床意义。
方法：采用多参数流式细胞术检测40例AML（包括初治AML及治疗后MRD）患者骨髓中CD69的表达率及表达强度，另选取10例MRD阴性的AML患者作为对照组。对照组患者经细胞形态学、流式细胞术、分子及遗传学检查证实其骨髓完全缓解状态。CD69表达强度计算，采用每个患者同一管标本中CD69阴性的淋巴细胞作为校准参照，分别计算对照组正常髓系原始细胞和实验组恶性髓系幼稚细胞CD69中位荧光强度（MFI）与其CD69阴性淋巴细胞CD69MFI比值（MFIR）。
结果：CD69在正常髓系原始细胞中不表达。在40例AML患者中，有17例（42.5%）CD69表达阳性或部分阳性。阳性病例肿瘤细胞MFIR为15.13+9.58，与对照组比较，具有显著性差异（P<0.01）。CD34+CD117+、CD34-/CD117+组为正常髓系原始细胞组，CD69阳性组和CD69阴性组为AML肿瘤细胞组。CD69阳性组MFIR高于CD69阴性组和正常对照组（P<0.01），后两者无显著性差异。
结论：CD69可以作为一个新的AML特异性抗原加入MRD检测方案中，并有望成为嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）治疗AML的一个新靶点。
三篇文章的通讯作者均为陆道培医疗集团检验科副主任、流式细胞室主任、信纳克实验室（CAP认证实验室）主任王卉教授。
陆道培医疗集团检验科副主任、流式细胞室主任、信纳克实验室主任（副院长级）。中国中西医结合学会检验专委会流式专委会主任委员；北京医学检验学会血液和体液检验分会副会长；中国非公立医疗机构协会血液委员会常委；中国临床流式联盟常委；中国抗癌协会淋巴瘤学组、中国血液免疫学会流式学组、中国生物工程学会细胞分析专委会、北京细胞生物学会等诸多学会常委、委员和特聘专家。从事流式临床诊断19年，独立签发30余万份报告；全国28个省（包括台湾）讲座600多场，为全国26个省（包括台湾）百家三甲医院培训了进修医。
科研创新，竞胜之道。陆道培医疗集团作为目前国内最大的造血干细胞移植中心，拥有专业的病理和检验医学团队，各实验室之间紧密协作，及时为临床一线医生提供精准的检验报告，为患者的正确诊断和治疗争取宝贵的时间，其检验报告的准确性和易读性得到业内的广泛认可。