流式细胞术在2020年欧洲血液学年会(EHA)上大放异彩
2020年新冠疫情全球肆虐,但疫情并未阻挡血液界学者对学术研究和交流分享的热情。承载众多看点的第25届欧洲血液学协会(EHA)年会,在大家的期待中采用线上虚拟会议的模式如期举行。
作为欧洲血液学领域规模最大的国际会议,EHA年会每年吸引来自全球100多个国家的上万名专业人士与会,一起分享、探讨有关血液学的创新理念及最新的科学和临床研究成果,能够登上EHA舞台,表示在血液学领域具有较高的学术水平。此次,陆道培医学团队有3项研究成果亮相EHA大会,向世界展示和分享陆道培医学团队最新科研成果。
研究一:使用cCD79a设门的多色流式可以有效监测CD19-CAR-T治疗B-ALL后MRD,并且预测桥接移植的预后
第一作者流式细胞室陈曼医师的文章“Multicolor Flow Cytometry Panel with cCD79A Gating to Detect Minimal Residual Disease in Patients with B-Lymphoblastic Leukemia/Lymphoma Post Anti-CD19 CAR-T Therapy Bridging to Allo-HSCT”(胞浆CD79a抗体设门多色流式法监测CD19-CAR-T桥接异基因移植治疗难治复发急性B淋巴细胞白血病)(摘要号:S113)被选为口头发言。
陆道培医疗集团在CD19嵌合抗原受体T(CD19-CAR-T)细胞治疗急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)中有丰富的经验,尤其是桥接异基因造血干细胞移植,挽救了无数难治复发患者生命。这类疾病的病情监测、疗效评价、预后评估中,流式细胞术(FCM)微小残留病变(MRD)检测技术起到不可或缺的作用。
但是常规的B-ALL的MRD多色流式检测方法均使用CD19设B细胞门,而CD19-CAR-T治疗后,由于13-60%的MRD阳性或者复发患者肿瘤细胞会或多或少丢失CD19,故不再适合使用传统方案监测MRD。以王卉主任、陈曼医师为代表的团队,探讨了陆道培医疗集团流式细胞室使用胞浆CD79a(cCD79a)抗体设门多色流式细胞术检测MRD方法在CD19-CAR-T治疗中的有效性,并研究其在输注后桥接异基因移植(allo-HSCT)整个治疗过程中的评价疗效及监测预后的作用。
实验中分别选取10例B-ALL完全缓解(CR)患者的骨髓标本及10例B-ALL MRD阳性的骨髓标本,同时使用新方案与经典方案进行检测,采用线性回归方法进行结果一致性分析,证实两种方案的一致性好。
然后选取2016年6月~2017年5月于河北燕达陆道培医院经CD19-CAR-T细胞输注后桥接移植的59例患者,使用新方案进行骨髓MRD监测,中位随访24月。其中51例(86.44%)患者CD19-CAR-T后FCM-MRD阴性,8例(13.56%)患者CAR-T细胞输注后MRD阳性或者复发。两组病例均在中位时间1-2个月左右进行了异基因造血干细胞移植。
经单因素卡方检验分析,CD19-CAR-T后移植前以及移植后FCM-MRD均与移植预后有强相关性(分别为P<0.0001,P=0.000)。59例患者中,移植后复发总计9例,其中7例死亡,4例为移植前FCM-MRD阳性患者(占带瘤移植组50%,4/8例),3例为FCM-MRD阴性移植患者(占MRD阴性移植组5.88%,3/51例),2例复发后缓解均为移植前FCM-MRD阴性患者。
结论认为,使用cCD79a设门的多色流式B-ALL检测MRD方案,可以有效监测CD19-CAR-T后MRD,并且预测CD19 CAR-T后桥接移植的预后。
研究二:流式细胞术微球法检测24种细胞因子在CAR-T治疗中的应用
第一作者细胞冻存室王东出医师的文章“EP403 Monitoring 24 Cytokines by Cytometric Bead Array during the Chimeric Antigen Receptor T Cells Treatment”(流式细胞术微球法检测24种细胞因子在嵌合抗原受体T细胞治疗中的应用)被选为墙报展示。
研究表明在CAR-T治疗中,多种细胞因子在细胞因子释放综合征(CRS)或者细胞因子风暴中起到重要作用,因此细胞因子检测是评价CAR-T副作用的重要指标。流式细胞微球阵列技术(CBA)是最近发展起来的一项新技术,与传统的ELISA方法相比,具有灵活、快速、高性价比、节约标本等优点。以王卉主任、王东出医师为代表细胞冻存室团队设计了一项新的24种细胞因子组合方案,使用CBA方法评价了其在CAR-T患者的脑脊液和外周血细胞因子检测中的作用。
他们首先进行了方法学对照性研究,收集了29例健康志愿者的外周血,25例回输CD19-CAR-T细胞后的ALL患者外周血标本,分别使用ELISA(Quantikine,RND)检测四种常见细胞因子(IL-6、IL-10、IFN-γ、可溶性CD25(sCD25)),与CBA(北京旷博公司)方法进行了比较。结果表明,每种技术均有很好的重复性,两者相关性很好。
为了研究CAR-T后细胞因子变化曲线,研究者选取的25例CAR-T治疗患者每人至少采集了5个时间点。由于标本量的问题,ELISA方法只做了正常对照和患者的外周血标本,CBA方法除了检测外周血标本,还对41例未做CAR-T的完全缓解患者脑脊液标本和15例CART治疗后脑脊液标本进行了检测。
结果表明,在健康对照和患者外周血标本组,虽然IL-6和sCD25检测的绝对值两种技术有差异,但是两种方法均可满意显示CAR-T治疗后细胞因子变化曲线,一致性很高。尤为重要的是,CBA技术检测脑脊液和外周血均有临床实用性强的特点。CBA方法可以一次完成24种细胞因子的检测,因此节约标本,让脑脊液这种微量标本检测成为可能;各种标本的检测中都解决了ELISA方法必须批量检测,随意性差的特点,相比之下检测时间短、性价比高,不论大批量还是急诊随机性标本都适合。
2020年2月起,陆道培医疗集团已经将CBA方法24种细胞因子检测技术全面推向临床,这项技术不仅可用于CAR-T治疗患者的监测,同时在各种良、恶性疾病的诊断、治疗,感染的免疫指标评价,移植物抗宿主病、CMV、EBV或者其他感染等移植后并发症的诊断、评价,噬血综合征等特殊免疫状态的监测与防治中,都起到极为重要的作用。
研究三:CD69在AML微小残留病变检测中的意义
第一作者流式细胞室宫美维医师的文章“The Clinical Significance of CD69 Detection in Minimal Residual Disease of Patiens with Acute Myeloid Leukemia”(CD69在急性髓系白血病微小残留病变检测中的意义)被选为大会论文集。
微小残留病变(MRD)是恶性血液病重要的疾病监控、判断预后、指导治疗的指标,目前临床常用的灵敏度较高的检测方法包括实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)、多色流式(MFC)等。MFC通过分析细胞抗原表达情况区分正常细胞与异常细胞,具有快速、性价比高、覆盖范围广、灵敏度高、特异性高的特点。目前流式细胞术对急性髓系白血病(AML)检测敏感性为10-3~10-4,虽然文献报道覆盖率为80-95%,但是临床工作中低比例(低于0.1%)MRD检测、以及缺乏特异性标志的标本检测仍旧遇到瓶颈。以王卉主任、宫美维医师为代表的流式细胞室团队进行了一项研究,探讨CD69在急性髓系白血病(AML)微小残留病变(MRD)检测中的临床意义。
方法:采用多参数流式细胞术检测40例AML(包括初治AML及治疗后MRD)患者骨髓中CD69的表达率及表达强度,另选取10例MRD阴性的AML患者作为对照组。对照组患者经细胞形态学、流式细胞术、分子及遗传学检查证实其骨髓完全缓解状态。CD69表达强度计算,采用每个患者同一管标本中CD69阴性的淋巴细胞作为校准参照,分别计算对照组正常髓系原始细胞和实验组恶性髓系幼稚细胞CD69中位荧光强度(MFI)与其CD69阴性淋巴细胞CD69MFI比值(MFIR)。
结果:CD69在正常髓系原始细胞中不表达。在40例AML患者中,有17例(42.5%)CD69表达阳性或部分阳性。阳性病例肿瘤细胞MFIR为15.13+9.58,与对照组比较,具有显著性差异(P<0.01)。CD34+CD117+、CD34-/CD117+组为正常髓系原始细胞组,CD69阳性组和CD69阴性组为AML肿瘤细胞组。CD69阳性组MFIR高于CD69阴性组和正常对照组(P<0.01),后两者无显著性差异。
结论:CD69可以作为一个新的AML特异性抗原加入MRD检测方案中,并有望成为嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)治疗AML的一个新靶点。
三篇文章的通讯作者均为陆道培医疗集团检验科副主任、流式细胞室主任、信纳克实验室(CAP认证实验室)主任王卉教授。
陆道培医疗集团检验科副主任、流式细胞室主任、信纳克实验室主任(副院长级)。中国中西医结合学会检验专委会流式专委会主任委员;北京医学检验学会血液和体液检验分会副会长;中国非公立医疗机构协会血液委员会常委;中国临床流式联盟常委;中国抗癌协会淋巴瘤学组、中国血液免疫学会流式学组、中国生物工程学会细胞分析专委会、北京细胞生物学会等诸多学会常委、委员和特聘专家。从事流式临床诊断19年,独立签发30余万份报告;全国28个省(包括台湾)讲座600多场,为全国26个省(包括台湾)百家三甲医院培训了进修医。
科研创新,竞胜之道。陆道培医疗集团作为目前国内最大的造血干细胞移植中心,拥有专业的病理和检验医学团队,各实验室之间紧密协作,及时为临床一线医生提供精准的检验报告,为患者的正确诊断和治疗争取宝贵的时间,其检验报告的准确性和易读性得到业内的广泛认可。